مقدمه: آنزیم گلوکز اکسیداز (b-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase; EC: 1.1.3.4) یک فلاووپروتئین است که باعث کاتالیز اکسیداسیون D-b گلوکز به مولکول d-گلوکونولاکتون و پراکسید هیدروژن به وسیله مولکول اکسیژن به عنوان پذیرنده الکترون می گردد. آنزیم گلوکز اکسیداز علاوه بر کاربردهای پزشکی آن در بیوسنسورها، در صنایع غذایی و تخمیر نیز نقش دارد. در این تحقیق، از کتیرا به عنوان ماتریکسی برای تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز استفاده شده و شرایط بهینه برای این آنزیم به دست آمده و مقایسه ای بین آنزیم آزاد و تثبیت شده صورت گرفته است.مواد و روش ها: آنزیم گلوکز اکسیداز در حامل طبیعی کتیرا به روش درگیر کردن در یک ژل پلیمری، تثبیت شد و اثرات پنج فاکتور pH، دما، غلظت گلوکز، غلظت آنزیم و فشار اکسیژن بر روی آنزیم تثبیت شده بررسی شده است. هم چنین فعالیت آنزیم به روش کنترل pH اندازه گیری شده است.یافته ها: شرایط بهینه آنزیم گلوکز اکسیداز برای انجام واکنش مذکور در دمای 36 درجه سانتی گراد، pH=6، غلظت گلوکز 100 میلی گرم و فشار اکسیژن 1 لیتر بر دقیقه بدست آمده است که در این شرایط آنزیم مذکور بیشترین فعالیت را نشان میدهد و تا 8 بار استفاده میزان 75درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ می کند.نتیجه گیری: با توجه به نتایج به دست آمده از فعالیت آنزیم گلوکز اکسیداز تثبیت شده در ژل کتیرا و مقایسه آن با آنزیم آزاد می توان نتیجه گرفت که استفاده از این پلیمر طبیعی جهت تثبیت برای این آنزیم مناسب و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است.

امروزه قارچ A. niger جهت تولید گلوکونیک اسید و آنزیم گلوکز اکسیداز در مقیاس وسیع بکار می رود. این آنزیم برای موارد متعدد کشاورزی و صنعتی و غذایی از جمله: حذف اکسیژن از محصولات غذایی به ویژه کنسروجات، در سیستم های لیگنینولیتیک جهت تجزیه چوب و خاک اره، نگهداری میوه جات برای مدت طولانی در سردخانه ها کاربرد دارد. از بین 17 سوش وحشی و دو سوش استاندارد قارچ A. niger، سوش NRRL-3 توسط روش رنگ آمیزی غیراختصاصی و اختصاصی کلونی های قارچی در محیط جامد، جهت کشت در محیط مایع انتخاب شد و سپس در محیط کشت مایع حاوی نمکهای معدنی، گلوکز و کربنات کلسیم، کشت داده شد و با تغییر غلظت یک عامل تشکیل دهنده محیط و ثابت نگه داشتن سایر پارامترها، روش one at a time بهترین محیط کشت مایع از نظر تولید آنزیم گلوکز اکسیداز، با غلظت مشخص عناصر تشکیل دهنده محیط به دست آمد. مهمترین عامل در تولید آنزیم در محیط کشت مایع طبق بررسی های به عمل آمده، غلظت گلوکزوکربنات کلسیم است. در انتهای کار سوش NRRL-3 توانست در محیط بهینه شده، آنزیم گلوکز اکسیداز را با فعالیت IU/ml 2.2 تولید کند.

بسترهای نانومتری چندلایه مبتنی بر گرافیت به عنوان حوزه ای جدید در طراحی و ساخت زیست کاتالیست­ ها ظهور کرده است. نانوسطح های لایه لایه و خودآرایی شونده می تواند سطح قابل دسترس چشمگیری برای استقرار داروها، سامانه­ های زیستی و آنزیم ­های فعال در تشخیص نشانگرهای زیستی فراهم آورد. در این مطالعه، یک بیوالکترود جدید با خودآرایی گرافن متخلخل و پلیمر غنی از گوانین ساخته شد. گرافن متخلخل که به صورت صفحات لوله­ ای روی هم تابیده شده است، آبگریز بوده و با پلیمر غنی از گوانین برای استقرار آنزیم گلوکز اکسیداز عامل دار شد. صفحات گرافنی به واسطه برهمکنش با پلیمر های اشباع از گوآنین در محیط آبی به صورت کامل توزیع شده است. پاسخ الکتروشیمیایی بیوالکترود به گلوکز به عنوان مدلی برای بیوالکتروکاتالیست مورد مطالعه قرار گرفت. بیوالکترود پاسخ خطی به غلظت گلوکز در محدوده 0.2 تا 2 میلی مولار، حساسیتی به میزان 0.092 میکرو آمپر/میکرومولار/سانتی­ متر مربع و حد تشخیص 0.086 میکرو مولار را  نشان داد. این پژوهش نشان داد که گرافن متخلخل می­ تواند برای ساخت رابط های بیوالکترونیکی و ساخت دستگاه های زیستی الکتروشیمیایی مورد استفاده قرار گیرد.

هدف: آنزیم گلوکزاکسیداز، واکنش اکسیداسیون -D گلوکز و تبدیل آن را به گلوکونیک اسید و H2O2 کاتالیز می کند. آسپرژیلوس نیجر از جمله منابع مهم تولید این آنزیم است. در این تحقیق روش انتخاب نمونه های آسپرژیلوس نیجر با قدرت بالا در تولید آنزیم گلوکزاکسیداز، روش بهینه سازی محیط کشت مایع از نظر تولید آنزیم، روش تخلیص آنزیم از شیره سلولی و محیط کشت و نیز برخی از خصوصیات فیزیکوشیمیایی آنزیم تخلیص شده ارایه و با آنزیم استاندارد مقایسه شد.مواد و روشها: 17 نمونه آسپرژیلوس نیجر طی دو مرحله از نظر تولید آنزیم گلوکزاکسیداز غربال شد. در مرحله اول انتخاب، نمونه های قارچی در محیط کشت تشخیصی غیر اختصاصی کشت داده شد. در مرحله دوم، نمونه های انتخاب شده در محیط کشت تشخیصی اختصاصی، که توانایی بالایی در شناسایی نمونه های با قدرت تولید بالای آنزیم دارد، کشت داده شد و نمونه NRRL-3 برای مراحل بهینه سازی محیط کشت مایع از نظر تولید آنزیم انتخاب شد. بهینه سازی به روش یک متغیر در یک زمان انجام شد و فعالیت ویژه آنزیمی از 0.172 به 0.22 رسید. سپس نمونه  NRRL-3 به منظور تولید مقدار بالای آنزیم، تحت شرایط بهینه شده در بیوراکتور کشت داده شد و پس از طی زمان انکوباسیون، محیط کشت و میسلیوم جمع آوری و برای طی مراحل تخلیص مورد استفاده قرار گرفت.نتایج و بحث: پس از انجام دادن مراحل تخلیص، که شامل کروماتوگرافیهای تعویض یونی بر روی -DEAE سلولز، فیلتراسیون بر روی سفاکریل S-300 و تعویض یونی بر روی -DEAE سفاروز CL-6B بود. فعالیت ویژه آنزیمی در شیره سلولی از 0.22 به 9.6 و در محیط کشت از 0.17 به 14.8 رسید. بازده روش تخلیص 9% و مرتبه خلوص آنزیم از شیره سلولی 89 و از محیط کشت 87 بود. وزن مولکولی آنزیم تخلیص شده در حالت دناتوره شده در حدود 80KD و 160KDa در حالت طبیعی تخمین زده شد. pH اپتیم برای فعالیت آنزیم بین 5.6 تا 5.8 بود. پس از بررسی اثر مهارکننده ها مشخص شد که اورتوفتالات در غلظت 10mM  به شدت آنزیم را مهار می کند وHg2+, Ag2+ ,Cu2+ هیدرازین و هیدروکسیل آمین همگی در غلظت  10mMاین عمل را به طور نسبی انجام می دهند. همچنین Km آنزیم برای گلوکز 37mM تعیین شد.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

مقدمه: امروزه با افزایش تقاضا برای انرژی، ساخت انواع بیوسلولهای سوختی، از اهمیت ویژ های برخوردار می باشد. بیوسلول سوختی، نوعی دستگاه مبدل انرژی است که از مواد زیستی به عنوان کاتالیست استفاده می نماید و می تواند، در انواع باتریها یا وسایل کاشتنی در بدن، یا حسگرهای زیستی کاربرد داشته باشد.هدف: این پژوهش، با هدف گسترش کاربردهای جدید نانولوله های کربنی، به عنوان ماده ای نوین جهت تسهیل انتقال مستقیم الکترون، بین مولکولهای زیستی و الکترود انجام پذیرفته است.روش بررسی: با توجه به ویژگیهای الکتریکی و مکانیکی منحصر بفرد نانولوله های کربنی، در این پژوهش از نانولوله های کربنی چند دیواره به منظور انتقال مستقیم الکترون آنزیم گلوکز اکسیداز و ساخت الکترود آندی بیوسلول سوختی استفاده شده است. بدین ترتیب که نانولوله های کربنی چند دیواره پس از فعال شدن، به صورت سوزنی شکل و با اتصال کووالان، به الکترود کار متصل شده و سپس آنزیم گلوکز اکسیداز به نانولوله های کربنی چند دیواره متصل می شود.نتایج: ناحیه پاسخ مستقیم بیوآند به غلظت گلوکز، بین 10 تا 40 میلی مولار و بیشینه پیک ردوکس، در 11 میکروآمپر و در غلظت 100 میلی مولار گلوکز ثبت شده است.نتیجه گیری: با توجه به نتایج بدست آمده، روش تثبیت معرفی شده نسبت به روشهایی که در آنها نانولوله های کربنی به صورت تصادفی روی سطح الکترود قرار می گیرند، دارای بازده بیشتری در تشدید انتقال مستقیم الکترون می باشد. نتایج حاصل از ولتامتری چرخ های، جفت پیک ردوکس مشخص را نشان می دهد که دلیلی بر انتقال مستقیم الکترون گلوکز اکسیداز تثبیت شده روی نانولوله های کربنی چند دیواره که به صورت سوزنی شکل قرار گرفته اند، می باشد. بنابراین، تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز با روش معرفی شده می تواند، در ساخت انواع بیوسلولهای سوختی و همچنین حسگرهای زیستی گلوکز مورد استفاده قرار بگیرد.

سابقه و هدف: گلوکز اکسیداز آنزیمی است که در صنایع غذایی، شیمیایی، آرایشی و بهداشتی و همچنین در کیتهای تشخیص گلوکز استفاده میشود. هدف این مطالعه شناسایی و جداسازی این ژن از ژنوم قارچ آسپرژیلوس نایجر از طریق PCR و کلونینگ آن در E. coli به منظور پایه ای برای تولید گلوکز اکسیداز نوترکیب در این است. مواد و روشها: قارچ آسپرژیلوس نایجر (ATCC 9029) در محیط حاوی پپتون و گلوکز و عصاره مالت و در حرارت 24 درجه سانتی گراد به مدت 72-48 ساعت کشت داده شد. DNA ژنومی قاچر به وسیله سونیکت کردن همراه با ساییدن قاچر سونیکت شده در نیتروژن مایع در بافر لیزکننده شامل EDTA و SDS استخراج شد. برای جداسازی ژن، یک جفت پرایمر طراحی شد و در شرایط بهینه شده PCR، ژن گلوکزاکسیداز تکثیر شد. سپس این ژن به وسیله Ins T/Aclon PCR~Tm Product cloning kit به داخل پلاسمید pTZ57R کلون و در داخل میزبان DH5α، E. coli ترانسفورم شد. نقشه ژنی این پلاسمید نوترکیب با آنزیمهای محدود کننده، تایید و پلاسمید نوترکیب pTA57RGO نامیده شد. یافته ها: نتایج نشان داد که روش استفاده شده در این مطالعه برای کشت و استخراج DNA از قارچهای رشته یا نظیر آسپرژیلوس مناسب است. همچنین ژن کد کننده آنزیم گلوکزاکسیداز که به وسیله تکنیک PCR جدا شده است دارای اندازه صحیح در آگاروز ژل الکتروفورزیس میباشد. ما نشان دادیم پلاسمید نوترکیب pTZ57RGO در Restriction analysis دارای الگوی صحیح میباشد. نتیجه گیری و توصیه ها: در این مطالعه ما ژن گلوکز اکسیداز را از طریق بهینه سازی شرایط PCR از آسپرژیلوس نایجر جدا و در یک میزبان پروکاریوتیک، کلون کردیم. این اولین گزارش از جداسازی و کلونینگ این ژن از طریق مهندسی ژنتیک در ایران است که میتواند برای کلونینگ در وکتور بیانی به منظور تولید این آنزیم به صورت نوترکیب به کار رود.